Xét nghiệm Mycoplasma trong nuôi cấy tế bào

Mycoplasma là tên gọi chung để chỉ các loài trong lớp Mollicutes (với các chi Mycoplasma, Acholeplasma, Spiroplasma, Anaeroplasma và Ureaplasma). Hầu hết các loài trong lớp Mollicutes đều sống ký sinh, nổi bật là bám dính, xâm nhập hoặc hợp nhất với tế bào chủ.

1. Nhiễm Mycoplasma – vấn đề nghiêm trọng trong nuôi cấy tế bào

Nhiễm Mycoplasma thường khó phát hiện và dễ bị bỏ sót, nhưng làm tế bào sinh trưởng chậm, ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất và biểu hiện gen, gây chuyển dạng tế bào, từ đó làm thay đổi kết quả của các nghiên cứu/thử nghiệm, thậm chí đe dọa đến sự an toàn của người sử dụng đối với sản phẩm dùng trong y học.

Trong số khoảng 20 loài Mollicute được xác định gây nhiễm trong nuôi cấy tế bào, 95% các trường hợp thuộc về 5 loài là Mycoplasma arginini, M. fermentas, M. hyorhinis, M. orale và Acholeplasma laidlawii. Xét nghiệm mycoplasma để đảm bảo độ tinh sạch và an toàn trong nuôi cấy tế bào là việc thực sự cần thiết, đặc biệt với các sản phẩm liệu pháp tế bào. Cơ quan Dược phẩm châu Âu (EMA), Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đều yêu cầu xét nghiệm Mycoplasma đối với các sản phẩm từ tế bào dự kiến được sử dụng trong lâm sàng.

Có thể là hình ảnh về con ve và văn bản cho biết 'DO YOU TEST FOR MYCOPLASMA? 15% OFUSLABS OF US LABS CONTAMINATED 50% OFUSLABS OF US LABS DO NOT TEST TO 35% OF CELLS IN CELL BANKS ARE CONTAMINATED IN US AND EUROPE OVER 60% CELL CONTAMINATION IN JAPAN 185 Biclopica Industrias BI 35% WORLDWIDE CONTAMINATION'

2. Các phương pháp xét nghiệm Mycoplasma

2.1. Phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch

- Được coi là phương pháp tiêu chuẩn tham chiếu trong các hướng dẫn thực hành sản xuất tốt (Good manufacturing practice – GMP) và trong dược điển, và là phương pháp tham chiếu cho các phương pháp khác.

- Phương pháp nuôi cấy dựa trên việc ủ dịch nuôi cấy tế bào trong môi trường cụ thể và sau đó phủ trên đĩa thạch một loại cơ chất tạo màu để phát hiện Mycoplasma. Các tế bào Mycoplasma được xác định dựa trên đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit –CFU) hoặc đơn vị đổi màu (color-changing unit – CCU). Việc xác định CCU vẫn là “tiêu chuẩn vàng” để phát hiện và định lượng Mycoplasma hoạt động có trong mẫu.

- Nhược điểm: Không phải tất cả các loài Mollicute đều phát triển trong một hoặc một vài môi trường xác định, đặc biệt là môi trường rắn; tính chính xác không cao do sự xác định chủ quan đối với kết quả CFU và CCU; thời gian thực hiện kéo dài, khoảng 21-28 ngày

- Vì vậy, phương pháp nuôi này thực tế khó áp dụng thường quy khi xác định nhiễm Mycoplasma trong nuôi cấy tế bào, đặc biệt là sản phẩm liệu pháp tế bào

2.2. Phương pháp PCR phát hiện trực tiếp Mycoplasma

- Phương pháp PCR được phát triển với mồi nhắm vào các trình tự được bảo tồn cao của các loài Mollicute phổ biến nhất gây nhiễm trong nuôi cấy tế bào, thường các mồi được sử dụng là RNA ribosome (rRNA) loại 16S, đôi khi rRNA 23S, hoặc protein bám dính P1

- Là phương pháp có nhiều ưu điểm với độ nhạy cao, thời gian ngắn

- Nhược điểm: kết quả âm tính giả/dương tính giả như các xét nghiệm khác theo phương pháp PCR, các trình tự mồi không đặc hiệu với tất cả các loài Mollicute

- Hiện tại đã có một số bộ sản phẩm thương mại được Cơ quan Dược phẩm châu Âu (European Medicines Agency), FDA Hòa Kỳ cấp phép để xét nghiệm Mycoplasma trong sản xuất dược phẩm

2.3. Các phương pháp phát hiện gián tiếp Mycoplasma

Một số phương pháp phổ biến bao gồm:

- Phát hiện enzyme chuyển hóa Mycoplasma tạo thành sản phẩm có thể phát hiện bằng đặc tính nhất định (Ví dụ: chuyển hóa ADP thành ATP, nhờ enzyme luciferase mà nó chuyển hóa luciferin thành dạng phát quang có thể phát hiện được bằng các máy quang phổ)

- Nuôi cấy tế bào chỉ thị, dùng các dòng tế bào dễ bị nhiễm Mollicute như VERO (dòng tế bào thận khỉ xanh châu Phi), NIH/3T3 (dòng tế bào nguyên bào sợi thai chuột)

- Nhuộm huỳnh quang với thuốc nhuộm axit nucleic (như 33258 hoặc DAPI)

3. Yêu cầu kiểm soát nhiễm Mycoplasma trong các sản phẩm liệu pháp tế bào

- FDA Hoa Kỳ yêu cầu tất cả các sản phẩm sinh học phải được xét nghiệm Mycoplasma, xét nghiệm phải được thực hiện trên dịch nuôi cấy, sản phẩm cuối hoặc nguyên liệu sinh học, với phương pháp nuôi cấy cổ điển trong môi trường đặc hiệu, hoặc phương pháp nhuộm huỳnh quang (PCR có thể chấp nhận nếu được chứng minh độ chính xác)

- Cơ quan Dược phẩm châu Âu (EMA) quy định bắt buộc kiểm tra Mycoplasma cho tế bào gốc, tế bào tăng sinh, dịch nuôi cấy, sản phẩm có nguồn gốc sinh học, trong đó chấp nhận phương pháp PCR nếu chứng minh được độ nhạy tương đương hoặc cao hơn phương pháp nuôi cấy truyền thống

- Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khẳng định xét nghiệm Mycoplasma là bắt buộc trường khi sản phẩm được dùng cho người, với phương pháp PCR có thể thay thế nuôi cấy truyền thống nếu được xác thực phù hợp

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. AABB (2009). Cellular Therapy : Principles, Methods, and Regulations. 1st Edition, edition E.M. Areman and K. Loper.

2. Young L., et al. (2010). Detection of Mycoplasma in cell cultures. Nature protocols, 5(5), 929-934.

3. Rottem S., et al. (2012). Contamination of tissue cultures by mycoplasmas. In Biomedical Tissue Culture. IntechOpen.

4. Code of federal regulations (CFR). General biological products standards. Title 21, CFR Part 610 - general biological products standards. Washington, DC: US Government Printing Office, 2009 (revised annually).

5. European Commission Health And Consumers Directorate-General (2010). EudraLex Volume 4 – GMP Guidelines for ATMPS, Part IV - GMP requirements for Advanced Therapy Medicinal Products.