Bảo quản đông lạnh tế bào

Nuôi cấy tế bào cơ bản: Mô hình nuôi cấy 2D và 3D Để đạt điều kiện tốt nhất khi nghiên cứu sinh học tế bào, các tế bào cần được phát triển trong môi trường mô phỏng càng giống loại mô quan tâm càng tốt. Vì vậy, các mô hình nuôi cấy trong không gian 3 chiều (3D) ngày càng được chú trọng đến, thay thế dần cho việc sử dụng các mô hình nuôi cấy phẳng (2D) trong nghiên cứu tế bào. 22/01/2026

Hình thái của tế bào trong nuôi cấy – Quan sát tế bào nuôi cấy dưới kính hiển vi Tế bào trong nuôi cấy có thể được chia thành ba dạng hình thái cơ bản: - Giống nguyên bào sợi (fibroblast-like): hình thoi dài và bám vào bề mặt giá thể để phát triển. - Giống biểu mô (epithelial-like): hình đa giác với kích thước đều đặn hơn, bám dính vào bề mặt giá thể thành từng mảng riêng biệt. - Giống nguyên bào lympho (lymphoblast): hình cầu, được nuôi cấy dạng huyền phù không bám dính vào bề mặt. Đôi khi một số ít tài liệu tách thêm ra một số nhóm nhỏ như dạng tế bào thần kinh, dạng giống tế bào nội mô,... tuy nhiên không điển hình. 22/01/2026

Khái quát quy trình nuôi cấy tế bào - Phân lập (isolation): quá trình phân tách một loại hoặc một số loại tế bào trong hỗn hợp (khối mô rắn như dây rốn, mô mỡ; hoặc huyền phù như dịch tủy xương, máu ngoại vi). - Tăng sinh (expansion): quá trình nuôi cấy một loại hoặc một số loại tế bào qua các thế hệ để gia tăng số lượng tế bào. - Cấy chuyển (subculture hay cell passaging): quá trình mở rộng không gian sinh trưởng của tế bào để chúng có thể tiếp tục tăng sinh. Quá trình từ khi phân lập tới lần cấy chuyển đầu tiên được gọi là nuôi cấy sơ cấp, từ sau lần cấy chuyển đầu tiên được gọi là nuôi cấy thứ cấp. - Cải biến: như chuyển gen, cảm ứng biệt hóa hoặc tái lập trình,... - Lưu trữ đông lạnh (cryopreservation hay cell freezing): bảo quản tế bào trong điều kiện lạnh sâu (-80°C hoặc dưới -150°C) để đưa tế bào vào trạng thái nghỉ, gián đoạn tạm thời quá trình tăng sinh của tế bào. - Rã đông (thawing): phục hồi trạng thái hoạt động tăng sinh của tế bào sau quá trình lưu trữ đông lạnh 22/01/2026

Tế bào sơ cấp và dòng tế bào - Nuôi cấy sơ cấp (primary culture) là quá trình nuôi cấy đầu tiên ngay sau khi phân lập tế bào quan tâm từ nguồn mô (dây rốn, mô mỡ, máu ngoại vi,...). Tập hợp tế bào nuôi cấy lúc này thường không đồng nhất với nhiều loại tế bào khác nhau. - Nuôi cấy thứ cấp (secondary culture) là quá trình sau khi nuôi cấy sơ cấp, các tế bào được cấy chuyển (subculture hay passaging) và nuôi cấy trong môi trường mới. Các tế bào đồng nhất hơn và có thời gian tồn tại lâu hơn. - Tế bào sơ cấp (primary cells) là những tế bào được phân lập trực tiếp từ nguồn mô, tương đối nhạy cảm với điều kiện nuôi cấy và có khả năng tăng sinh hữu hạn. - Dòng tế bào (cell lines) là một nhóm các tế bào được hình thành từ quá trình nuôi cấy sơ cấp tạo nên nhóm các tế bào thuần khiết, thường biểu hiện các đặc điểm chức năng gần giống với các tế bào sơ cấp, nhưng kiểu gen và kiểu hình của tế bào có thể bị biến đổi. - Dòng tế bào hữu hạn (finite cell lines) là dòng tế bào mà các tế bào phân chia một số lần giới hạn khi nuôi cấy (thường là 20-100 lần), sau đó ngừng phân chia và đi vào pha suy vong. - Dòng tế bào liên tục (continuous cell lines) hay dòng tế bào bất tử (immortalised cell lines) là dòng tế bào mà các tế bào phân chia vô hạn trong quá trình nuôi cấy. Phương pháp tạo ra các dòng tế bào này có thể là nuôi cấy tế bào với các hóa chất hoặc cho nhiễm virus làm tăng sinh mất kiểm soát. Đa số các dòng tế bào thương mại được tạo ra bằng cách cho nhiễm virus tạo nên bất tử, gọi là dòng tế bào biến đổi (transformed cell lines). - Mô hình sinh trưởng của tế bào: Khi mới được cấy (seeding), ban đầu tế bào cần thích nghi với môi trường nuôi cấy nên số lượng tế bào giảm nhẹ do một số tế bào không thích nghi được bị chết đi (pha tiềm phát). Sau đó, số lượng tế bào tăng dần, tế bào được phân chia liên tiếp và tăng sinh nhanh về số lượng (pha sinh trưởng hay pha lũy thừa), người ta cần liên tục mở rộng không gian sinh trưởng để duy trì tế bào ở pha này, ví dụ cấy chuyển (subculture hay passaging) để mở rộng diện tích bề mặt đối với tế bào bám dính hay tăng thể tích nuôi cấy đối với nuôi cấy huyền phù. Đến một thời điểm nhất định, mặc dù được cung cấp điều kiện lý tưởng nhưng số lượng tế bào không tăng, duy trì cân bằng (pha cân bằng) rồi giảm dần do tế bào không phân chia mà chết dần (pha suy vong). - Trong nhiều thập kỷ, các nhà khoa học thường sử dụng các dòng tế bào để thực hiện các nghiên cứu, thử nghiệm. Tuy nhiên, các tế bào qua quá trình nuôi cấy lâu dài thường bị biến đổi cả về kiểu gen và kiểu hình, nên không còn giữ hoàn toàn những đặc điểm giống như nguồn mô ban đầu. Những tế bào này cũng thường có sức sống mãnh liệt, ít nhạy cảm với điều kiện môi trường, nên khó đánh giá khi thay đổi điều kiện thử nghiệm. - Hiện nay, các nhóm nghiên cứu có xu hướng chuyển dịch về sử dụng tế bào sơ cấp để thử nghiệm. Những tế bào này vẫn giữ được đa số các đặc điểm từ nguồn mô phân lập ra nó, và rất nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện nuôi cấy, nên trở thành công cụ tốt để nghiên cứu thử nghiệm. 22/01/2026

Cấy chuyển tế bào Cấy chuyển tế bào (subculturing/passaging the cells) được thực hiện bằng cách chuyển một số hoặc toàn bộ các tế bào từ môi trường nuôi cấy trước đó sang môi trường tăng trưởng mới. 22/01/2026

Xác định số lượng tế bào Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu: - Buồng đếm hồng cầu (hemocytometer hay haemocytometer) ban đầu được thiết kế để đếm tế bào máu, là tấm kính dày có kẻ các vạch phân chia thành các ô kích thước cụ thể và khi đậy lamel thì tạo độ sâu nhất định, từ đó có thể tính toán số lượng tế bào trong một đơn vị thể tích. - Có nhiều loại buồng đếm khác nhau, thường dùng nhất là buồng đếm dạng Neubauer (cấu trúc các ô và cách như mô tả ở Hình 1). - Thường kết hợp với xác định tỷ lệ tế bào sống bằng cách pha cùng Trypan blue 0,4% theo tỷ lệ 1:1 (lúc này lưu ý là mật độ tế bào giảm 2 lần) - Các bước thực hiện: (1) Pha loãng mẫu về nồng độ thích hợp, pha loãng cùng Trypan blue 0,4% để xác định tỷ lệ tế bào sống (nếu cần) (2) Chuyển mẫu vào giữa ô đếm (3) Nhẹ nhàng đậy lamel sao cho tránh bọt khí và huyền phù dàn đầy các ô đếm (4) Đưa lên kính hiển vi, sau 3-5 phút thì đếm tế bào sống (không bắt màu Trypan blue), tế bào chết (bắt màu xanh đen) - Một số lưu ý (trước khi đọc, bạn hãy thử đếm số lượng tế bào trong Hình 1) + Nên pha loãng mẫu sao cho mỗi ô vuông nhỏ có khoảng 5-10 tế bào (trung bình không ít hơn 2,5 tế bào), mỗi ô vuông lớn có khoảng 10-50 tế bào + Với mỗi ô vuông lớn cần đếm các tế bào nằm trọn vẹn trong ô, và các tế bào nằm trên 2 cạnh vuông góc với nhau, ví dụ cạnh trên và cạnh phải (hãy chú ý trong Hình 1: nếu quy ước đếm cạnh trên và cạnh phải thì ô B cần tính 2 tế bào ở cạnh phải và không đếm 1 tế bào cạnh dưới, ô E tính cần tính 1 tế bào ở cạnh trên và không tính 1 tế bào ở cạnh dưới) + Các cụm tế bào chỉ tính là 1 "hạt" (1 event), không đếm máy móc từng tế bào trong cụm (hãy chú ý cụm 3 tế bào ở ô B, chúng ta chỉ tính 1) ---------- Đếm tế bào bằng máy đếm tự động: - Hiện trên thị trường có nhiều dòng máy khác nhau như Countess (ThermoFisher Scientific), Eve (NanoEntek), CellDrop (DeNovix),... - Ưu điểm: thao tác nhanh chóng và tự động, có xuất báo cáo từ thiết bị để lưu trữ hồ sơ - Có nhiều chức năng nâng cao như tự khoanh vùng cụm tế bào, đếm tế bào huỳnh quang,... Ví dụ: Kết quả đếm tế bào trên máy Countess 3 Automated Cell Counter (ThermoFisher Scientific) (Hình 2) 22/01/2026

Tuổi thọ của tế bào trong nuôi cấy - Một thực tế rất rõ ràng là khi nuôi cấy tế bào bám dính, chúng ta sẽ không xác định những tế bào đó đã sống bao nhiêu ngày, bao nhiêu tháng,... (việc này thường chỉ thực hiện khi nuôi tế bào miễn dịch, các loại tế bào đã biệt hóa,...). - Khi nói đến tuổi tế bào, người ta thường nhắc đến số lần cấy chuyển (subculture hay passage), trước đây người ta thường cấy chuyển theo tỷ lệ 1:2 (từ 1 diện tích ban đầu mở rộng diện tích ra gấp 2 lần, ví dụ 1 chai T75 thành 2 chai T75) nên có tính đồng nhất cao giữa các nhóm nghiên cứu hay các phòng thí nghiệm. - Tuy nhiên hiện tại, với sự hỗ trợ của các loại môi trường thương mại và giá thể nuôi cấy trên thị trường, tỷ lệ cấy chuyển có sự khác nhau lớn và rất xa con số 1:2. Ví dụ cùng cấy tế bào gốc trung mô (MSC) với mật độ 4.000 tế bào/cm2 trên chai T75 (cấy 0,3 triệu tế bào/chai), nếu thu được 3,0 triệu tế bào thì thế hệ tiếp tiếp theo cấy chuyển tỷ lệ 1:10, nếu thu được 4,5 triệu tế bào thì thế hệ tiếp tiếp theo cấy chuyển tỷ lệ 1:15. Vì thế số lần cấy chuyển không phản ánh đúng "tuổi" của tế bào, do tỷ lệ cấy chuyển càng cao thì tế bào càng nhanh tiến đến giới hạn Hayflick. - Công cụ tính toán hợp lý nhất được đề xuất hiện nay là số lần nhân đôi quần thể, tính tương quan dựa theo số tế bào thu được và số tế bào gieo ban đầu của cùng một lần cấy chuyển (công thức trên hình minh họa). Số lần nhân đôi quần thể có liên quan đến thời gian nhân đôi quần thể (doubling time) được dùng khá phổ biến để đánh giá tốc độ sinh trưởng của tế bào. Lưu ý: các công thức được tính gần đúng, bỏ qua các tế bào chết trong quá trình nuôi cấy. - Tương quan giữa số lần cấy chuyển và số lần nhân đôi quần thể: Tỷ lệ cấy chuyển khác nhau dẫn đến số lượng tế bào thu ở thế hệ tiếp theo khác nhau, tức là số lần phân bào của tế bào cũng khác nhau. Ví dụ cùng cấy chuyển 6 lần, nếu cấy tỷ lệ 1:10 thì trung bình từ 1 tế bào tạo ra 1 triệu (10^6) tế bào, tương đương với tế bào trải qua khoảng 20 lần nhân đôi (2^20 ~ 1x10^6); nhưng nếu cấy tỷ lệ 1:15 thì trung bình từ 1 tế bào tạo ra 170 triệu (15^6) tế bào, tương đương với tế bào trải qua khoảng 27 lần nhân đôi, tức là đã tiến gần hơn đến giới hạn Hayflick (nhanh già hơn). - Mặc dù số lần nhân đôi quần thể là công cụ có vẻ hợp lý nhất hiện nay, và thời gian nhân đôi quần thể (doubling time) được sử dụng phổ biến, tuy nhiên thực tế là người ta vẫn quá quen thuộc khi dùng số lần cấy chuyển để nói về tuổi của tế bào trong nuôi cấy. 22/01/2026

Một ví dụ cho thấy sự khác biệt rõ ràng khi sử dụng mô hình 2D và 3D trong thử nghiệm Trong mô hình 2D, các tế bào phát triển trên bề mặt phẳng, không mô phỏng được cấu trúc mô in vivo như mô hình 3D, do đó kém hơn trong việc phản ánh sự tương tác tế bào - tế bào và tế bào - môi trường. 22/01/2026

Môi trường nuôi cấy tế bào – Môi trường cơ bản Tế bào cần được nuôi dưỡng trong môi trường mô phỏng càng giống cơ thể càng tốt, cung cấp cho chúng những chất dinh dưỡng cần thiết, các yếu tố tăng trưởng, hormone,… để phát triển. 22/01/2026

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào: Huyết thanh Huyết thanh được thêm vào môi trường nuôi cấy đa số các loại tế bào động vật với nồng độ 2-10% theo thể tích để cung cấp hỗn hợp các chất dinh dưỡng, yếu tố tăng trưởng, yếu tố vi lượng,... cho tế bào. Loại huyết thanh thường được sử dụng nhất là huyết thanh thai bò (fetal bovine serum - FBS), chứa hơn 1.000 thành phần như yếu tố tăng trưởng, hormone, protein khác, lipid, khoáng chất, đệm pH,… 22/01/2026

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào: Đỏ phenol Đỏ phenol (phenol red, hay phenolsulfonphthalein) được sử dụng rộng rãi trong môi trường nuôi cấy tế bào như một chất chỉ thị pH 22/01/2026

Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào: muối bicarbonate - Môi trường nuôi cấy tế bào phải chứa hệ thống đệm để duy trì độ pH ổn định (thường nằm trong khoảng từ 7,2 đến 7,4 đối với nhiều đa số các loại tế bào động vật). Hệ đệm gồm CO2 (kèm độ ẩm) và muối bicarbonate được sử dụng phổ biến nhất trong nuôi cấy tế bào H2O + CO2 H+ + HCO3¯ - Thông thường, nồng độ bicarbonate được sử dụng phổ biến là 26 mM. Khi đó, với tỷ lệ CO2 ở mức 4,5% – 6,5% so với thể tích không khí cung cấp cho tủ nuôi cấy thì độ pH được duy trì trong khoảng 7,2 – 7,4 là giá trị tối ưu cho đa số các loại tế bào động vật sinh trưởng (vùng giữa đường kẻ ngang màu đỏ và đường kẻ ngang màu xanh lá trên hình ảnh minh họa). Các tủ nuôi cấy thường điều chỉnh CO2 ở mức 5% thể tích không khí. - Riêng DMEM có nồng độ bicarbonate là 44 mM, khi đó để duy trì pH 7,2 – 7,4 thì tỷ lệ CO2 thích hợp là 7,5% – 11% trong không khí. Với CO2 ở mức 5%, pH của DMEM là 7,5, là giá trị chấp nhận được nhưng thực tế nằm ngoài phạm vi pH tối ưu (hình minh họa). --------- Ngoài ra, HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid) là một loại đệm cũng được sử dụng khá nhiều trong nuôi cấy tế bào. HEPES là đệm hữu cơ lưỡng tính, mạnh hơn bicarbonate, duy trì pH trong khoảng 6,8 – 8,2, tuy nhiên có thể gây độc đối với một số loại tế bào ở nồng độ nhất định tùy loại tế bào. Khi sử dụng đệm HEPES thì không cần cung cấp CO2 cho tủ nuôi cấy. 22/01/2026